Argumento de Purificación de ácido Eicosapentaenoico (epa) Mediante Reacciones Enzimáticas
Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) tienen importantes funciones fisiológicas como tales ácidos libres o como triglicéridos. En el grupo de investigación de Biotecnología de Microalgas Marinas de la Universidad de Almería se han puesto a punto métodos para su obtención con alta pureza a partir de aceites de pescado y de microalgas marinas. Estos métodos han sido seleccionados fundamentalmente en función de su eficiencia, es decir, de su viabilidad técica, rendimientos, purezas obtenidas, etc.
Este trabajo se engloba dentro de un proyecto de obtención de PUFAs marcados con isótopos estables de carbono 13 procedentes de la biomasa de la microalga Phaeodactylum tricornutum. El ácido graso mayoritario de los lípidos de esta biomasa es el ácido eicosapentaenoico (EPA, 23%), que es un PUFA n-3, con numerosos beneficios descritos para la salud.
La concentración de PUFAs a partir de extractos de ácidos grasos libres (AGLs) se ha llevado a cabo en nuestro laboratorio por distintos procedimientos, como el método de los compuestos de inclusión de urea y la cromatografía líquida. Sin embargo, las industrias farmacéutica y agroalimentaria, que son las que demandan estos PUFAs, buscan, cada vez más, métodos saludables de obtención que preserven al máximo la estabilidad de los PUFAs y que sean poco
contaminantes.
En este trabajo se aborda el estudio de las etapas de un proceso de obtención y concentración de PUFAs que cumpla estos requisitos, además de proporcionar la mayor eficiencia posible. Estas etapasuna mezcla hidroetanólica (40% en agua, p/p) con hexano en una relación hexano/disolución hidroalcohólica 5:1, v/v se consiguieron recuperar del orden del 95% de los lípidos contenidos en dicho extracto.
Se obtuvieron las concentraciones de equilibrio de distribución de los lípidos saponificables entre las fases hexánica e hidroalcohólica (40% en agua, p/p). Utilizando estos datos de equilibrio es posible predecir el comportamiento de la extracción bifásica con distintas
relaciones de disolventes y distinto número de etapas de extracción.
El proceso de extracción puesto a punto es una alternativa a los métodos tradicionales de extracción de lípidos y permite un ahorro considerable de disolventes.
La obtención de PUFAs y de ácidos grasos libres (AGLs) en general a partir de extractos lipídicos puede hacerse por saponificación alcalina a temperaturas de 60-80 ºC o por hidrólisis enzimática. Numerosos autores han puesto de manifiesto que este último método es una alternativa atractiva ya que se realiza en condiciones más suaves (30-45 ºC, pH 6-7), que
evitan los riesgos de isomerización de los PUFAs y produce aguas residuales menos contaminadas. Además, dado el carácter específico de las lipasas, los procesos enzimáticos podrían presentar la ventaja de discriminar o seleccionar entre los diferentes ácidos grasos, de
forma que los PUFAs (o más concretamente el EPA) se concentrasen durante la acción hidrolítica de las lipasas.
Encontradas las condiciones de partida apropiadas, se ha comparado la acción hidrolítica de nueve lipasas. A la vista de los resultados, desde un punto de vista práctico, la hidrólisis de los
glicéridos no puede considerarse como un método apropiado para
concentrar el EPA pero las lipasas de Rhizopus oryzae, Alcaligines
spp., Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas cepacia son las más apropiadas para obtener ácidos grasos libres con un contenido en EPA alto.
Optimizando las condiciones de operación (relación agua/aceite, temperatura e intensidad de tratamiento, definida como el producto del tiempo por la cantidad de lipasa) con la lipasa AK de
Pseudomonas fluorescens se han alcanzado grados de hidrólisis superiores al 80% y rendimientos de obtención de EPA en la fracción de AGLs del 77%, que son resultados competitivos con los obtenidos mediante técnicas no enzimáticas.
Los resultados obtenidos (grados de hidrólisis y fracciones molares de EPA en los AGLs, con respecto al EPA total) con las cuatro mejores lipasas se han ajustado a un modelo cinético simple que se basa en considerar que la velocidad de hidrólisis es proporcional al
alejamiento del equilibrio.
Diferentes autores han descrito que algunas enzimas muestran acil-selectividad en la esterificación de ácidos grasos con alcoholes. La esterificación preferente de otros ácidos grasos ha permitido un enriquecimiento de algunos PUFAs, como el ácido -linolénico (GLA) o el ácido docosohexaenoico (DHA), en la fracción de ácidos grasos sin esterificar.
Tras ensayos previos con extractos de AGLs de aceite de hígado de bacalao (rico en EPA y DHA) se ensayaron hasta nueve lipasas con aceite comercial EPAX4510TG (43% en EPA) en esterificaciones con dodecanol en relación molar 1:2, añadiendo agua (en torno al 2,5%
v/v con respecto la mezcla de reacción) y usando hexano como disolvente y diferentes temperaturas. En estas condiciones, las lipasas AK de P. fluorescens, EU-093 de R. delemar y D de R. oryzae mostraron la mayor discriminación hacia el EPA con respecto a los demás AGLs en la esterificación, de forma que el EPA se concentra en la fracción de AGLs más que con las otras lipasas.0
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